在本研究中，當(dāng)?shù)词芟拗茣r(shí)，銨態(tài)氮比硝酸鹽更容易刺激銅綠假單胞菌的初始生長(zhǎng)。即使當(dāng)細(xì)胞再次缺乏氮時(shí)，再添加氮源后，氨組相對(duì)于硝酸鹽組也觀察到快速生長(zhǎng)。當(dāng)以銨態(tài)氮供應(yīng)充足的培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)時(shí)，從第5天開始的7天內(nèi)，銅綠假單胞菌的生長(zhǎng)變慢，而在同一時(shí)期觀察到硝酸鹽組促進(jìn)了生長(zhǎng)，是銨處理的1.36倍。同時(shí)測(cè)定培養(yǎng)液中氮含量的變化，結(jié)果顯示與細(xì)胞的生長(zhǎng)結(jié)果一致。

圖1. 不同氮營(yíng)養(yǎng)條件下銅綠假單胞菌生長(zhǎng)和氮利用的變化。

銅綠假單胞菌對(duì)銨供應(yīng)的快速生長(zhǎng)反應(yīng)，培養(yǎng)一天后，所有銨組的凈光合速率迅速增加，顯著高于硝酸鹽組。然而，在培養(yǎng)基中的氮含量耗盡后，2 mg/L氮處理組P_n值開始下降。這進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了光合作用和氮代謝之間的密切關(guān)系。在10 mg-N/L組中，充足的硝酸鹽供應(yīng)確保了P_n的持續(xù)增加，之后由于氮耗盡，P_n降低。然而，氨氮處理的P_n在兩天后急劇下降，一直低于初始值直到培養(yǎng)結(jié)束。這表明細(xì)胞周圍過量的銨離子含量導(dǎo)致綠膿桿菌光合作用的下調(diào)。綜合分析，將氧釋放的減少可能歸因于兩個(gè)方面：一是由于過量的光能積累導(dǎo)致PSII的下調(diào)，另一個(gè)是通過與銨離子和水分子之間的OEC結(jié)合位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)減少光驅(qū)動(dòng)的水氧化。

圖2. 不同氮營(yíng)養(yǎng)條件下銅綠假單胞菌光合放氧（P_n）和飽和輻照度（Isat）的變化。

測(cè)定每個(gè)樣本的MC產(chǎn)量，并將其計(jì)算為細(xì)胞配額值。結(jié)果表明硝酸鹽培養(yǎng)有利于MC的生物合成，氮饑餓誘導(dǎo)毒素產(chǎn)生。當(dāng)提供足夠的氮時(shí)，硝酸鹽下的MC總量在培養(yǎng)期間沒有顯著變化，但過量的銨會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)MC釋放到環(huán)境中。

圖3：不同氮營(yíng)養(yǎng)條件下銅綠微囊藻胞內(nèi)MC和胞外MC的變化

當(dāng)環(huán)境中氮的濃度和形態(tài)隨著營(yíng)養(yǎng)條件的改變，細(xì)胞內(nèi)氮代謝途徑也相應(yīng)改變。轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果表明，在硝酸鹽培養(yǎng)的銅綠假單胞菌和氨氮培養(yǎng)的銅綠假單胞菌之間，超過14%的總基因表達(dá)存在顯著差異。其中，400個(gè)基因上調(diào)，365個(gè)基因在硝酸鹽條件下相對(duì)于銨態(tài)氮水平下調(diào)（圖4A）。DEGs的層次聚類顯示，具有類似功能或參與相同生物過程的基因聚集在同一組中，并且在組內(nèi)的樣本中觀察到DEGs表達(dá)的重復(fù)性較好。

對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析，結(jié)果表明，493個(gè)DEG主要注釋為21個(gè)GO功能分類。在生物過程類別中，含有大量DEG的次要功能是金屬過程、細(xì)胞過程、生長(zhǎng)和對(duì)刺激的反應(yīng)，其中基因數(shù)量占所有富集基因的30.22%。細(xì)胞成分類別中，其中更多的基因富集在細(xì)胞和膜類別中。分子功能類別，其中51個(gè)基因在分子功能分支中高度富集。

KEGG富集分析結(jié)果顯示，217個(gè)DEG被分別富集到85個(gè)KEGG通路中。其中67.28%基因在代謝通路中富集，包括能量代謝、碳水化合物代謝和氨基酸代謝等。此外，還富集到很多代謝途徑，如ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體、氧化磷酸化、光合作用，脂肪酸生物合成等等。

圖4. 在硝酸鹽上生長(zhǎng)的銅綠假單胞菌中DEGs的聚類、GO網(wǎng)絡(luò)分析和KEGG富集。

藍(lán)藻含有吸收不同氮營(yíng)養(yǎng)素的特定轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。編碼ABC型硝酸鹽/亞硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體的nrtABCD基因、編碼鐵氧還蛋白-亞硝酸鹽還原酶的nirA基因、narB基因和鐵氧還蛋白-硝酸還原酶基因的表達(dá)在硝酸鹽環(huán)境下上調(diào)。這些基因通常存在于一個(gè)操縱子中，控制硝酸鹽的吸收和同化。在氮的儲(chǔ)存方面，生長(zhǎng)在硝酸鹽上的銅綠假單胞菌最為突出。該操縱子可能存在于銅綠假單胞菌中。然而，與聚球藻和魚腥藻不同，在銅綠假單胞菌中未檢測(cè)到glnK和nifI的表達(dá)，并且glnB的轉(zhuǎn)錄水平未發(fā)生差異性改變。銅綠假單胞菌PII及其編碼基因的功能有待進(jìn)一步研究。

當(dāng)向綠膿桿菌提供硝酸鹽時(shí)，光合作用相關(guān)基因的表達(dá)通常上調(diào)，與生長(zhǎng)和生理變化一致。有趣的是，在銨脅迫下，銅綠假單胞菌光合作用不良的情況下，幾個(gè)基因的表達(dá)顯著上調(diào)。氨脅迫下，psbA基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)上調(diào)。psbA編碼的D1蛋白是光介導(dǎo)的PSII損傷的主要靶點(diǎn)。因此，psbA的顯著上調(diào)證實(shí)了P_n和Isat的變化所表明的結(jié)論，即充足的銨誘導(dǎo)光氧化PSII中的損壞。

RNA-seq結(jié)果顯示，碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和NdhF3~F4復(fù)合物，將細(xì)胞內(nèi)CO₂轉(zhuǎn)化為銨態(tài)氮，相關(guān)編碼基因上調(diào)。這些基因負(fù)責(zé)CO₂ 藍(lán)藻中依賴于光能的濃縮機(jī)制（CCM），因此，銅綠假單胞菌也通過CCM維持其光合作用中的能量平衡。

圖5. 綠膿桿菌氮代謝和光合作用的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

sRNAs通過調(diào)控mRNAs的翻譯和降解速率，在基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。為了更好地了解銅綠假單胞菌如何適應(yīng)氮供應(yīng)形式的變化，本研究確定了sRNAs及其靶點(diǎn)。結(jié)果表明，在硝酸鹽和氨氮條件下培養(yǎng)的銅綠假單胞菌中檢測(cè)到37個(gè)sRNA及其可能的靶蛋白編碼基因的表達(dá)。然而，只有sRNA00003被注釋為已知的藍(lán)藻sRNA，即氮脅迫誘導(dǎo)的RNA 4（NsiR4）。近期有研究表明，NsiR4主要作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，通過靶向編碼GS失活因子7的gifA基因和編碼含有DUF4090結(jié)構(gòu)域的未知功能蛋白質(zhì)的ssr1528基因，在GS的調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。然而，NsiR4對(duì)不同氮形態(tài)的反應(yīng)目前尚不清楚。

對(duì)sRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，并構(gòu)建互作用網(wǎng)絡(luò)。在4個(gè)sRNA（sRNA0004、sRNA0013、sRNA0022、sRNA0023）的目標(biāo)中，超過20個(gè)。這些靶點(diǎn)涉及多種代謝途徑，如氮的運(yùn)輸和儲(chǔ)存、光合器官的組裝、MC的產(chǎn)生、CO₂的固定。這些發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步的研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，這將為藍(lán)藻如何利用sRNAs整合多種調(diào)節(jié)途徑以響應(yīng)營(yíng)養(yǎng)變化提供新的線索。

圖6. 調(diào)節(jié)對(duì)氮形態(tài)變化適應(yīng)的sRNA-靶基因相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。